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本制品可以催化5'端磷酸化的单链DNA或单链RNA (pDNA or pRNA)转换生成5'端腺苷酰化DNA (AppDNA)或5'端腺苷酰化RNA (AppRNA)。无论作为底物的DNA或RNA的3'端是否进行了氨基化等封闭，使用本制品都可以高效催化产生5'端腺苷酰化产物。在反应体系中不存在ATP的条件下，本制品还可以催化5'端磷酸化的单链DNA (pDNA)生成环状DNA (circular DNA)。本制品进行5'端腺苷酰化修饰反应时，需要ATP和待腺苷酰化修饰的5'端磷酸化的单链DNA或单链RNA。

以5'端磷酸化的单链DNA或单链RNA为底物，本制品首先将ATP分解成AMP和PPi，接着AMP转移到单链DNA或单链RNA的5'磷酸基团上，之后形成腺苷酰化单链DNA或单链RNA，从而生成腺苷酰化产物。


制备5'端腺苷酰化的单链DNA接头，最终用于miRNA等3'端为羟基的RNA或3'端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3'端添加的接头。


来源于嗜热菌的腺苷酰化酶基因在大肠杆菌中进行表达纯化而获得。


一个单位是在20μL反应体积中，65℃条件下，催化1pmol AMP在15分钟内转移到pDNA底物所需的酶量。

组分	3kU	15kU
5' ssDNA/ssRNA Adenylase(75U/μL)	40μL	200μL
10×Adenylase Reaction Buffer	100μL	500μL

保存：-20℃，有效期2年。


不含DNA内切酶和外切酶，不含核糖核酸酶。


85℃加热5min可使5' ssDNA/ssRNA Adenylase失活。



图1.我司的5' ssDNA/ssRNA Adenylase催化5'端磷酸化的单链DNA (pDNA)转化成腺苷酰化DNA (AppDNA)的效果图。在20μL反应体系中加入5μM pDNA，0.1mM ATP，图中指定量的5' ssDNA/ssRNA Adenylase，65℃分别孵育1h和2h，反应完毕后85℃孵育5min以终止反应。然后每个样品各取1.5μL反应产物，加入2μL 6×DNA Loading buffer，补足水至最终体积为12μL，95℃孵育5min，随后立即冰浴放置，变性聚丙烯酰胺凝胶(15%，7M尿素)进行凝胶电泳分析。如图所示，反应进行1h需要100U的5' ssDNA/ssRNA Adenylase可以将5'端磷酸化单链DNA充分转化成腺苷酰化单链DNA；而反应进行2h则只需要50U的5' ssDNA/ssRNA Adenylase就可以将5'端磷酸化单链DNA充分转化成腺苷酰化单链DNA。

• 底物单链DNA或单链RNA的5'端磷酸化是必须的，3'端可以进行氨基化等封闭，也可以不封闭；不进行3'端氨基化等封闭时，建议将ATP的浓度增加至0.5mM，可以避免底物发生环化或串联反应。
  
• 本制品不能连接双链DNA (dsDNA)之间的缺刻。
  
• 本制品的最佳反应温度为65℃，并且在25℃时会出现去腺苷酰化现象，因此反应完成后推荐在85℃孵育5min以失活5' ssDNA/ssRNA Adenylase。如果没有充分失活5' ssDNA/ssRNA Adenylase，后续经历室温温度条件时，会导致腺苷酰化比例下降。
  
• 本制品使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

• 解冻5'端腺苷酰化修饰反应所需的各种试剂，将5' ssDNA/ssRNA adenylase置于冰上或冰盒内。
  
• 参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  Water(DNase/RNase free)	14μL	-
  ssDNA or ssRNA (100μM)	1μL	5μM
  10×Adenylase Reaction Buffer	2μL	1×
  ATP (1mM)	2μL	0.1mM
  5' ssDNA/ssRNA adenylase(75U/μL)	1μL	3.75U/μL
  总体积	20μL	-

  • 如果同时进行多个腺苷酰化反应，可以把上表中除ssDNA或ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
    
  • 如果涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。如果涉及单链RNA，推荐适量添加RNase抑制剂。
• 腺苷酰化反应：65℃孵育1h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长反应时间。
  
• 终止反应：85℃孵育5min以终止反应。
  
• 腺苷酰化产物的电泳鉴定：电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴，以充分变性。尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。腺苷酰化修饰后分子量会变大一点(参考图1)。
  
• 浓缩及后续用途：可以采用常规的乙醇沉淀方法进行浓缩，后续可以使用T4 Rnl2tr等用于和小RNA等的3'羟基的连接反应。

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